"Кто мы и как сюда попали". Глава из книги
Глава 2. Встреча с неандертальцами (отрывок)
<...>
Неандертальская ДНК
В ранних исследованиях древней ДНК ученых интересовала практически исключительно митохондриальная ДНК. И тому было две причины. Во-первых, в каждой клетке имеется около тысячи копий мтДНК, что по сравнению с двумя копиями остального генома сильно увеличивает вероятность ее обнаружить. Во-вторых, высокая плотность информации в мтДНК: какой бы фрагмент мтДНК ни взять, в нем будет относительно больше различий, чем в подавляющем большинстве фрагментов остального генома, а значит, по нему можно получить более точные измерения времени генетического разделения последовательностей, которые удавалось реконструировать. Сравнение мтДНК неандертальцев и современных людей подтверждало, что они имели более позднего общего предка по материнской линии, чем считалось до того1. На сегодня датировки оценены интервалом 470–360 тысяч лет назад2. Также эти данные свидетельствуют о глубоких различиях между нами и неандертальцами. Неандертальская мтДНК по своей изменчивости выходит за пределы изменчивости мтДНК сегодняшних людей, и наша с ними общая прародительница в несколько раз древнее, чем "митохондриальная Ева"3.
Неандертальская мтДНК никак не подтверждает гипотезу о скрещивании современных людей и неандертальцев при их гипотетических встречах, но при этом не исключает такой возможности, оставляя вероятность, что в геноме неафриканского нынешнего населения присутствует до 25% неандертальской ДНК4.
Можно понять, почему нам так сложно утверждать что-то о неандертальском наследии в нашем геноме на основании только мтДНК. Предположим, что скрещивание было и у неафриканского населения имеется заметная часть неандертальской ДНК, но мтДНК могла попасть к нам лишь от женщин-носительниц, при этом из всех матерей лишь немногие, жившие в те далекие времена, имели шанс донести до нас свою ДНК. А если добавить, что из тех счастливых матерей большая часть принадлежала к сапиенсам, то картина нашей сегодняшней мтДНК никого удивить не должна. Так что мтДНК на этот счет не слишком показательна. Однако долгое время в научных кругах принято было считать, что современные люди и неандертальцы не скрещивались... пока группа Сванте Пэабо не прочитала полный геном неандертальца и тем самым не открыла возможность увидеть историю всех предков, а не только по "женской" линии.
Мощный рывок в секвенировании неандертальского генома стал возможен благодаря гигантскому скачку в технологиях изучения палео-ДНК, произошедшему спустя десятилетие после прочтения митохондриального генома неандертальца.
До 2010 года основной упор в работах по древней ДНК делался на ПЦР, полимеразную цепную реакцию. Она предполагает выбор целевого фрагмента генома, когда с помощью синтезированных коротких, примерно двадцатибуквенных, кусочков ДНК, комплементарных к обоим концам целевого фрагмента, его можно выделить из общей массы экстрагированной ДНК. А затем много раз размножить с помощью определенных ферментов. Иными словами, из всего генома нужно выделить крошечную часть и сделать ее самой массовой последовательностью в образце. Этот метод отбрасывает большую часть генома (нецелевую часть), хотя и вычленяет интересующий участок.
Новый подход был кардинально другим. Он предполагал секвенирование всей ДНК, какая найдется в образце, вне зависимости от того, из какой она части генома, и без всякого предварительного целевого выбора. Это стало возможно благодаря зверской мощности новых машин, которые с 2006 по 2010 год снизили стоимость секвенирования в тысячу раз. Далее данные такого безвыборочного секвенирования анализируются с помощью компьютерных программ, и прочитанные кусочки складываются в практически целый геном, или же в зависимости от задачи можно сложить конкретные гены.
Команде Пэабо пришлось преодолеть великое множество трудностей при разработке этого подхода. Для начала необходимо было найти кости, из которых ДНК экстрагировалась бы в нужном количестве. Антропологи часто работают с фоссилиями (окаменелостями) — костями, минерализованными до состояния камня. Но из таких окаменелостей никакая ДНК не выделяется. Поэтому Пэабо искал материал, не до конца минерализованный, где оставалось немного органики, включая и хорошо сохранившиеся цепочки ДНК. Положим, такой "золотой образец" найден, но в нем помимо сохранившейся собственной ДНК будет еще и ДНК микробов и грибов, поселившихся в костях после смерти индивида, так что следующий шаг — как-то обойти проблему микробных загрязнений. А ведь эти загрязнения и составляют подавляющую часть ДНК в древних образцах. И наконец, необходимо учитывать и загрязнения, пришедшие от самих исследователей — археологов или молекулярных биологов, державших в руках образцы и реактивы и оставивших в них следы собственных ДНК.
Вообще загрязнения — серьезная проблема при изучении древней человеческой ДНК. Эти загрязнения могут запутать исследователя, ведь кость-то человеческая, а тот, кто подержал в руках окаменелую кость, является пусть и очень дальним, но все же родственником тому древнему человеку. Как правило, из хорошо сохранившейся неандертальской кости выделяются фрагменты длиной около сорока букв, а плотность различий между человеческой и неандертальской ДНК составляет примерно одно различие на шестьсот букв, так что порой невозможно сказать, кому принадлежит конкретный сорокабуквенный кусочек — древнему человеку или тому, кто подержал кость в руках. И загрязнения снова и снова сбивают исследователей с толку. Так, в 2006 году Пэабо со своей группой в качестве подготовки в полногеномному секвенированию неандертальца отсеквенировал на пробу около миллиона букв ДНК из его генома5. И большая часть полученной последовательности оказалась современным загрязнением, что поставило под сомнение дальнейшую интерпретацию результатов6.
Сейчас применяются различные методы снижения риска загрязнений при исследовании древней ДНК, они уже были в ходу и в 2006 году, но после этого значительно усовершенствовались, вобрав набор крайних мер гигиенической предосторожности. К 2010 году команда Пэабо успешно отсеквенировала неандертальский геном без загрязнений, и для этого с каждым образцом они работали в "чистой комнате", устроенной по образу чистых помещений в производстве микрочипов в компьютерной индустрии. В таком помещении на потолке ультрафиолетовая (УФ) лампа наподобие тех, что имеются в операционных, которая включается, как только оттуда выходит исследователь; ультрафиолет превращает ДНК в форму, которую невозможно отсеквенировать. Естественно, при этом разрушается и древняя ДНК, находящаяся на поверхности образца, но ученые высверливают образцы, беря пробы из-под поверхности, а там ДНК не разрушена. Воздух в помещении очищен ультрафильтрацией, убирающей мельчайшие частички пыли — меньше одной тысячной толщины волоса, — ведь и на пыли может быть ДНК. А чтобы защитить помещение от проникновения ДНК извне, воздух принудительно гонится наружу из помещения, а не наоборот.
В таком помещении три комнаты. В первой исследователь облачается в специальный чистый костюм, перчатки и маску. Во второй образец кости, предназначенный для взятия пробы, отправляется в камеру с высоким УФ-излучением, чтобы преобразовать поверхностные ДНК-загрязнения в нечитаемую форму. Затем исследователь с помощью зубного бура высверливает из костного образца от десятков до сотен миллиграммов материала, собирая его в алюминиевую фольгу, предварительно обработанную УФ, и ссыпает оттуда в пробирку, естественно тоже обработанную УФ. В третьей камере порошок погружается в жидкость с веществами, растворяющими кости и белки, а потом этот раствор пропускается через чистый песок (оксид кремния); при правильных условиях оксид кремния связывает молекулы ДНК, а остальные вещества, мешающие реакциям секвенирования, удаляются.
После этого полученные фрагменты ДНК преобразуют для секвенирования. Для этого сначала удаляют поврежденные концы фрагментов: за десятки тысяч лет "хранения" под землей цепочки с концов сильно разрушаются. Потом в качестве меры для распознания загрязнений к уже очищенным концам прицепляют специально синтезированные последовательности букв, своего рода химический штрихкод древних фрагментов — этот метод был опробован в 2006 году группой Пэабо. Любое загрязнение, появившееся в образце после присоединения такого штрихкода, можно будет отличить от древних фрагментов. И наконец, к одному из концов ДНК присоединяют молекулы-адаптеры, и они позволяют запустить секвенирование на тех самых новых машинах, что сделали этот процесс в десятки тысяч раз дешевле.
Лучше всего ДНК сохранилась, как выяснилось, в трех неандертальских образцах из пещеры Виндия в высокогорной Хорватии — это остатки костей рук и ног, датированных примерно 40 тысячами лет. Отсеквенировав экстракты ДНК из них, группа Пэабо выяснила, что подавляющая часть этой ДНК принадлежит поселившимся в костях бактериям и грибам. Однако после сравнения миллионов фрагментов с геномами шимпанзе и человека Пэабо в тоннах пустой "молекулярной" породы удалось найти золото. Референсные геномы человека и шимпанзе послужили своего рода картинкой на коробке с пазлом, подсказкой, как собирать крошечные отсеквенированные кусочки неандертальской ДНК в одну цепь. В итоге в тех костях оказалось около 4% древней ДНК неандертальцев.
И когда в 2007 году Пэабо понял, что смог бы в принципе отсеквенировать полный геном неандертальца, он собрал международную команду специалистов, которая как раз и должна была работать с данными секвенирования. Вот так я и мой старший научный наставник, математик Ник Паттерсон, попали в этот проект. Пэабо пригласил нас, потому что в предыдущие пять лет мы зарекомендовали себя новаторами в области изучения популяционных перемешиваний. Я много раз ездил в Германию, немало сделал для обработки и анализа данных, доказавших скрещивание между неандертальцами и какими-то ранними современными людьми.
Как неандертальцы породнились с неафриканским населением
В том неандертальском геноме, который мы прочитали, содержалось, к сожалению, великое множество ошибок. Откуда мы это знали? Из того факта, что, судя по прочтенным данным, в неандертальской линии накопилось в несколько раз больше мутаций, чем в линии современных людей после их отделения от общего предка. А так как скорость накопления мутаций примерно постоянная и неандертальские кости имеют солидный возраст, то есть неандертальцы ближе к общему предку, чем нынешние люди, большинство выявленных неандертальских отличий не могут быть настоящими, на самом деле мутаций должно быть меньше. По полученным оценкам, в неандертальском геноме на каждые две сотни прочтенных ДНК-букв приходилась одна ошибка. Может показаться, что это не очень много, но такое количество ошибок существенно превышает действительную мутационную разницу между неандертальцами и современными людьми, и большая часть выявленных различий порождена методическими огрехами. Как поступить в этом случае? Решено было выбрать для анализа только те позиции в геноме, в которых у людей нынешних популяций имеются отличия. И тогда ошибка в 0,5% (1 из 200 нуклеотидов) вполне допустима, она не влияет на интерпретацию результатов. С упором на такие позиции мы разработали математический тест, измеряющий степень отличия неандертальского генома от той или иной человеческой популяции — будут ли отличия одинаковыми или разными?
Наш подход назывался "тест четырех популяций", и он стал основным рабочим инструментом в задаче сравнения любых популяций. На входе в каждом из четырех геномов — например, два современных, неандертальский и шимпанзе — берется одна конкретная позиция, и в ней читаются буквы ДНК. Нужно обращать внимание на те позиции, где в одной из двух популяций современных людей произошла мутация (то есть один из вариантов архаический, как у шимпанзе, а другой с мутацией), а у неандертальцев в этой позиции имеется та же самая мутация; это будет означать, что мутация произошла до окончательного разделения современных людей и неандертальцев. И после выяснить, на какую из двух популяций неандертальцы больше похожи по своим мутациям. Если обе современные популяции унаследовали свои мутации от предковой группы, отделившейся до разделения линий людей и неандертальцев, то нет никаких оснований считать, что в этих двух популяциях мутации распределены неравномерно, то есть что неандертальцы должны быть больше похожи на одну из этих популяций; как раз наоборот, неандертальцы должны быть одинаково похожи на обе популяции. Но если неандертальцы и одна из двух популяций современных людей скрещивались, то потомки этой "гибридной" популяции должны иметь больше общих мутаций с неандертальцами.
И когда мы проверили нынешние популяции людей, то обнаружилось, что неандертальцы в равной мере похожи на европейцев, азиатов и новогвинейцев, но меньше похожи на африканское население к югу от Сахары (сюда входят совсем разные группы из Западной Африки и бушмены, охотники-собиратели Южной Африки), чем на все неафриканское население. Разница выглядела небольшой, но вероятность, что это различие случайно, равнялась одной квадриллионной. И каким бы образом мы ни обсчитывали данные, результат оставался именно таким. Эта разница должна была появиться, если неандертальцы скрещивались с предками неафриканского населения, но не с предками африканцев.
<...>
1 M. Krings et al. "Neandertal DNA Sequences and the Origin of Modern Humans", Cell 90 (1997): 19–30.
2 C. Posth et al. "Deeply Divergent Archaic Mitochondrial Genome Provides Lower Time Boundary for African Gene Flow into Neanderthals", Nature Communications 8 (2017): 16046.
3 Krings et al. "Neandertal DNA Sequences"
4 M. Currat, L. Excoffier. "Modern Humans Did Not Admix with Neanderthals During Their Range Expansion into Europe", PLoS Biology 2 (2004): e421; D. Serre et al. "No Evidence of Neandertal mtDNA Contribution to Early Modern Humans", PLoS Biology 2 (2004): e57; M. Nordborg."On the Probability of Neanderthal Ancestry", American Journal of Human Genetics 63 (1998): 1237–1240.
5 R. E. Green et al. "Analysis of One Million Base Pairs of Neanderthal DNA", Nature 444 (2006): 330–336.
6 J. D. Wall and S. K. Kim. "Inconsistencies in Neanderthal Genomic DNA Sequences", PLoS Genetics 3 (2007): 1862–1866.